ИФА иссследования гормонов половой сферы 1



Лекция 14

ИФА исследования гормонов половой сферы.

ИФА исследования инфекций передающихся половым путем (ИППП).

Диагностика гепатитов.

Термин «гормон» впервые был введен Бейлисом и Старлингом в 1902 г. для обозначения физиологически активного вещества, выделяемого слизистой оболочкой кишечника (секретина).

К гормонам в настоящее время относят разнообразные по химической природе биологически активные вещества, вырабатываемые в специализированных органах – эндокринных желез (в переводе с греческого «эндо» внутрь, «кринеин»- отделяю). Отделение секрета происходит непосредственно в кровь.

К железам внутренней секреции относят: гипофиз, эпифиз, щитовидная железа, паращитовидные железы, зобная железа, поджелудочная железа (смешанной секреции), надпочечники, половые железы (семенники, яичники), желтое тело, плацента.

Отдельно выделяют тканевые гормоны (серотонин, гистамин), производящие эффект в месте выработки. К гормонам очень близки медиаторы, посредники нервного возбуждения: ацетилхолин, дофамин, норадреналин и др. К гормонам причисляют биологически активные вещества, выделяемые специализированными клетками ЦНС (либерины, статины, окситоцин, антидиуритический гормон), слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта (гастрин, секретин, холецистокинин, панкреозимин), почек (эритропоэтин), хориона (хорионический гонадотропин) и др.

Эндокринные органы оказывают своими секретами мощное воздействие не только на внутренние паренхиматозные органы, но и на другие эндокринные железы и ЦНС.

В свою очередь, деятельность эндокринных желез не автономна, а находится под контролем коры и подкорковых центров регуляции. На этом принципе базируется функционирование гипоталамо-гипофизарной системы.

Установлено, что секреция всех гормонов передней доли гипофиза (соматотропина, тиротропина, кортикотропина, фоллитропина, лютропина, пролактина) находится под контролем веществ пептидной природы, образующихся в процессе нейросекреции в гипоталамусе и способных усиливать или уменьшать образование тропных гормонов гипофиза. Это либерины и статины, которые воздействуют на переднюю долю гипофиза, вызывая усиленное образование и отделение в кровь тропных гормонов гипофиза. Под их влиянием возрастает секреторная активность коры надпочечников, щитовидной железы, половых желез. Гормоны периферических эндокринных органов, оказавшихся в крови в повышенном количестве, в свою очередь, воздействуя на гипоталамус, вызывая торможение процесса образования и секреции в кровь тропных гормонов, и наоборот, при низком уровне гормонов этот процесс тормозится.

Другие гормоны – окситоцин и антидиуритический (образующиеся в супраоптических и паравентрикулярных ядрах гипоталамуса) по аксонам нервных проводников спускаются в заднюю долю гипофиза, где депонируются.

Гормоны гипофиза:

- передняя доля - соматотропин, тиротропин (ТТГ), кортикотропин (АКТГ), фоллитропин (ФСГ), лютропин (ЛГ), пролактин (ЛТГ, лютеотропный);

- средняя доля – меланоформный гормон;

- задняя доля – депонируются антидиуритический гормон (вазопрессин) и окситоцин.

Гонадотропные гормоны образуются в базофильных клетках, находятся под контролем гипаталомических центров. В передней доле гипофиза – ФСГ (гликопротеин), ЛГ (гликопротеин), ЛТГ (белок).

Половые гормоны.

Мужские половые гормоны

Тестостерон – стероидный гормон с молекулярным весом 288,4 Да (вырабатывается клетками Лейдига семенников у мужчин и корой надпочечников и яичниками у женщин).

97-98% - в крови в связанном с белками состоянии, биологической активностью обладает только свободный тестостерон (около 2%).

Тестостерон контролирует сперматогенез, функцию простаты и потенцию.

Показания к исследованию:

- у мужчин – тестикулярная недостаточность, бесплодие, импотенция, геникомастия;

- у женщин – гирсутизм, опухоли яичника, продуцирующие тестостерон; поликистоз яичников, нарушение менструального цикла, аменорея, бесплодие.

Основными причинами снижения концентрации тестостерона у мужчин – длительный алкоголизм, стресс и физическое истощение.

Поскольку уровень тестостерона подвергается циклическому изменению в течение суток, необходимо брать пробы 3 раза в течение 1 ч между 8 -10 ч утра и анализировать смешанную пробу. У женщин пробу берут на 3-7 день менструального цикла.

В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата тестостерон - пероксидаза, во время инкубации устанавливается равновесие между конъюгатом и эндогенным тестостероном сыворотки крови в процессе связывания с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. При удалении содержимого из лунок происходит разделение свободного и связанного с антителами тестостерона и конъюгата тестостерон-пероксидаза, причем количество связанного с антителами конъюгата обратно пропорционально количеству тестостерона в образце сыворотки крови. Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связанного антителами конъюгата тестостерон-пероксидаза. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация тестостерона в исследуемых образцах.

Норма:    Мужчины: 12,1 - 38,3 нмоль/л

      Женщины: 0,5 - 4,3 нмоль/л

 

Женские половые гормоны.

Фолликулостимулирующий гормон ФСГ (созревание фолликулов и овуляция):

– повышение при недостаточности функции яичников;

- норма или понижение на фоне уменьшения ЛГ – нарушение функции гипофиза или гипоталамуса.

ФСГ – гликопротеиновый гормон с молекулярным весом около 30 000 Да, состоящий из двух субъединиц – альфа и бета. ФСГ секретируется базофильными клетками передней доли гипофиза.

У мужчин ФСГ наряду ЛГ (лютеинизирующим гормоном) и тестостероном, необходим для поддержания сперматогенеза. У женщин, достигших половой зрелости, ФСГ стимулирует рост и созревание фолликулов в яичниках.

Повышенные уровни ФСГ наблюдаются у пациентов с различными формами гипоггонадизма (первичная недостаточность яичников и семенников, поликистоз яичников менопауза и пр.), а также в результате кастрации, при почечной недостаточности и циррозе.

При злокачественных опухолях семенников наблюдается понижение уровня ФСГ.

Диагностическое значение имеет определение ФСГ при определении менопаузы, точного времени овуляции и мониторинге эндокринной терапии.

При определении ФСГ использован «сэндвич» - вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к ФСГ

Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена. В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата анти-ФСГ - пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация ФСГ, содержащегося в исследуемом образце, и связывание его с конъюгатом. При удалении содержимого из лунок и промывка происходит удаление избытка конъюгата анти-ФСГ – пероксидаза, не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации ФСГ. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству ФСГ в исследуемом образце.

Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна концентрации ФСГ в анализируемых пробах. После измерения оптичесой плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация свободного ФСГ в исследуемых образцах.

Норма: Мужчины: 1,0 – 11,8 мМЕ/мл

Женщины: Фолликулиновой фазе 1,8 – 11,3 мМЕ/мл

         В овуляторном пике – 4,9 – 20,4 мМЕ/мл

         В лютеиновой фазе 1,1 – 9,5 мМЕ/мл

         В постменопаузе – 31,0 – 130 мМЕ/мл

Эстрогены – эстрадиол, эстрон, и эстриол (вырабатываются яичниками, желтым телом и плацентой, в небольшом кол-ве они образуются в коре надпочечников и семенниках).

Эстрадиол – у женщин детородного возраста – прямой индикатор фолликулярной активности. Гиперсекреция в менопаузе – повышенный синтез опухолевыми тканями.

Эстриол - стероидный гормон, синтезируемый плацентой (показатель функции фетоплацентарной системы).

Прогестерон – важный промежуточный продукт биосинтеза стероидных гормонов (например, андрогенов в коре надпочечников). Биологическая роль заключается в подготовке стимулированного эстрогенами эндометрия к имплантации оплодотворенной яйцеклетки.

Прогестерон - стероидный гормон с молекулярной массой 314 Да.

Количественное определение уровня прогестерона в крови имеет диагностическое значение при оценке функционального состояния желтого тела, наблюдении за протеканием беременности.

В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата прогестерон - пероксидаза, во время инкубации устанавливается равновесие между конъюгатом и эндогенным прогестероном сыворотки крови в процессе связывания с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. При удалении содержимого из лунок происходит разделение свободного и связанного с антителами прогестерона и конъюгата прогестерон-пероксидаза, причем количество связанного с антителами конъюгата обратно пропорционально количеству прогестерона в образце сыворотки крови. Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна концентрации прогестерона в анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация прогестерона в исследуемых образцах.

Норма: Мужчины: 0,5-5,2 нмоль/л

    Женщины:    Фоликулиновая фаза 0,5- 6 нмоль/л

            Лютеиновая фаза 10- 89 нмоль/л

 

Хорионический гонадотропин – наиболее важный из гестационных гормонов. Идеальный тест для быстрой диагностики беременности. Физиологическая роль ХГ в ранние сроки – стимуляция синтеза прогестерона желтым телом.

Альфа-фетопротеин – является специфическим фетальным альфа-глобулином и вырабатывается желтым телом. Контроль за протеканием первого триместра беременности, угроза выкидыша, диагностика врожденных пороков развития и хромосомных аберраций. Высокий уровень – гепатоцеллюлярной карциномой, злокачественными опухолями желчного пузыря и поджелудочной железы, тератомами, опухолями с эмбриональным происхождением.

Лютеининизирующий гормон (ЛГ) - гликопротеиновый гормон с молекулярным весом около 30 000 Да+ состоящий из двух субъединиц – альфа и бета.

У мужчин ЛГ стимулирует синтез тестостерона, у женщин в регуляции менструального цикла. Повышенные уровни ЛГ наблюдаются у пациентов с различными формами гипогонадизма (первичная недостаточность яичников и семенников, поликистоз яичников менопауза и пр.), а также в результате кастрации, при почечной недостаточности и циррозе.

При дисфункциях передней доле гипофиза или гипоталамуса наблюдаются пониженные уровни ЛГ, которые могут являться причиной бесплодия у обоих полов, а также имеет диагностическое значение при определении менопаузы, точного времени овуляции и мониторинге эндокринной терапии.

При определении ЛГ используются «сэндвич» - вариант твердофазного иммуноферментного анализа.

Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к ЛГ. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена. В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата анти-ЛГ-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация ЛГ, содержащегося в исследуемом образце, и связывание образовавшегося комплекса с конъюгатом.

При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата анти-ЛГ-пероксидаза, не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации ЛГ. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству ЛГ в исследуемом образце. Во время инкубации происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна концентрации ЛГ в анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация ЛГ в исследуемых пробах.

Норма: Мужчины: 0,8 -8,4 мкМЕ/мл

Женщины: Фолликулиновой фазе 1,1 – 8,7 мМЕ/мл

         В овуляторном пике – 13,2 – 72 мМЕ/мл

         В лютеиновой фазе 0,9 – 14,4 мМЕ/мл

          В постменопаузе – 18,6 – 72 мМЕ/мл

Пролактин является полипептидным гормоном с молекулярной массой около 23 000 Да. Определение пролактина имеет диагностическое значение при нарушении функций половых желез у обоих полов.

У женщин при гиперпролактинемии может отмечаться галакторея, аменорея или ряд других нарушений менструального цикла в то время как у мужчины могут страдать потерей либидо или импотенцией. Измерение пролактина имеет значение как первичный тест на бесплодие.

Патологическая гиперпролактинемия имеет место при гипотиреодизме, почечной недостаточности, пролактиномой (секретирующей пролактин опухолью гипофиза).

Физиологическое повышение - во время беременности, лактации, сна и при физическом и эмоциональном стрессе.

При определении пролактина используется «сэндвич» - вариант твердофазного иммуноферментного анализа.

Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к пролактину. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена. В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата антипролактин-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация пролактина, содержащегося в исследуемом образце, и связывание образовавшегося комплекса с конъюгатом. Несвязавшиеся компоненты удаляются промывкой.

Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству пролактина в исследуемом образце. Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна концентрации пролактина в анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация пролактина в исследуемых образцах.

Норма:     Мужчины: 105 - 540 мМЕ/л

Женщины: 67 – 726 мМЕ/л

ИФА диагностика ИППП (инфекций, передающихся половым путем).

 

ИФА диагностика вирусных гепатитов.

В настоящее время выделяют две основные формы клинического течения гепатитов: острую и хроническую.

   Острая форма течения характерна для гепатитов вирусной природы, а также для гепатитов, вызванных отравлениями сильными ядами. При острой форме гепатита наблюдается ухудшение общего состояния организма, развитие признаков общей интоксикации организма и нарушение функции печени, а также повышение уровня трансаминаз и общего билирубина в крови. Острый гепатит, как правило, заканчивается выздоровлением больного, однако в некоторых случаях наблюдается переход острого течения болезни в хроническое.

   Хроническая форма может развиваться самостоятельно (например, при хроническом отравлении этиловым спиртом), или продолжать развитие острого гепатита (вирусный гепатит В, D) долгое время протекающего бессимптомно. Характерно стойкое увеличение размеров печени, тупые боли в правом подреберье, непереносимость жирной пищи ит.др. При хроническом гепатите клетки печени постепенно замещаются соединительной тканью, что ведет к развитию цирроза печени. Пациенты, страдающие хроническим гепатитом, подвержены высокому риску развития первичного рака печени.

 

Причины возникновения гепатитов.

Воспаление печени (гепатит) может быть вызвано различными гепатотропными факторами.

Этиотропная классификация гепатитов включает:

1. Инфекционный (вирусный) гепатит:

Гепатиты А, В, С, D, E, F, G, TTV.

Гепатиты как компонент: желтой лихорадки, цитомегаловирусной инфекции, краснухи, эпидемического паротита, инфекции вируса Эпштейна –Барр, разнообразных инфекций герпеса, лихорадки Ласса, СПИДа.

Бактериальные гепатиты: при лептоспирозе, сифилисе.

2. Токсический гепатит:

Алкогольный гепатит;

Лекарственный гепатит;

Гепатиты при отравлении различными химическими веществами.

3. Лучевой гепатит (компонент лучевой болезни).

4. Гепатиты как следствие аутоиммунных заболеваний.

Пути передачи вирусов гепатитов:

- вертикальная (перинатальная) передача;

- передача в быту;

- заражение при приеме наркотиков;

- заражение при медицинских процедурах;

- половой путь;

- парентерально.

Диагностика гепатитов.

Современная диагностика гепатитов опирается на:

1. Клинические признаки и симптомы (печень увеличена и болезненна);

2. Клинический анамнез пациента;

3. Биохимический анализ сыворотки (увеличение трансаминаз, высокий уровень билирубина)4

4. Серологический анализ.

Специфическая иммунологическая диагностика – выявление маркеров вирусного гепатита:

- антигенов вируса,

- антител к антигенам вируса (общие антитела, антитела класса IgM, антитела класса IgG).

   5. Генодиагностический анализ (выявление ДНК/РНК вируса).

 

1.Основые критерии достоверности лабораторных тестов на ИППП.

Обоснованный выбор методов лабораторной диагностики ИППП и правильная трактовка полученных результатов не достижимы без четких представлений о достоверности различных лабораторных тестов. В своем подавляющем большинстве анализы на ИППП не подлежат количественной оценке и направлены на выявление лишь двух противоположных значений – положительного либо отрицательного результата. В таких случаях основными критериями диагностической надежности любого вида тестирования на ИППП являются чувствительность и специфичность.[7,8].

В качестве дополнительных практически важных показателей рассчитываются предсказательная значимость положительного и отрицательного результатов. Ниже приведены характеристики и способы расчета критериев, которые должны правильно пониматься не только врачами-лаборантами, но и клиническими специалистами, получающими справочную информацию о рабочих возможностях тестов, которые используются ими для диагностики ИППП.

Чувствительность - степень вероятности (в %) выявления каким-либо тестом положительного результата у больного пациента. Чувствительность теста составляет 100%, если он дает возможность определить положительный результат у всех больных.

Специфичность - степень вероятности (в %) выявление каким-либо тестом отрицательного результата у человека, не имеющего данного заболевания. Специфичность теста составляет 100 % если он дает возможность определить отрицательный результат у всех здоровых.

Истинно положительный результат (ИП) – положительный результат теста, полученный при обследовании больных пациентов.

Ложноположительный результат (ЛП) положительный результат теста, полученный при обследовании людей, не имеющих данного заболевания (в более надежном тесте будет установлен отрицательный ответ).

Истинно отрицательный результат (ИО) – отрицательный результат теста, полученный при обследовании людей, не имеющих данного заболевания.

Ложноотрицательный результат (ЛО) – отрицательный результат теста, полученный при обследовании больных пациентов (в более надежном тесте будет установлен положительный ответ).

 

Попытки совмещения этих параметров на уровне 100% в одном методе, за редким исключением, безуспешны. Те или иные способы тестирования отличаются превосходством либо чувствительности, либо специфичности, обуславливая в первом случае риск получения ложноположительных результатов, а во втором – ложноотрицательных ответов. В связи с этим тесты с высокой чувствительностью более эффективны для исключения заболевания, поскольку риск получения ложноотрицательного ответа в них минимален.

Краткая характеристика наиболее распространенных методов диагностики ИППП.

1. Микроскопия в проходящем свете.

Чувствительность метода не выше 40-80 % из-за сравнительно низкой разрешающей способности световой микроскопии требующей наличия не менее 109 микробных тел в 1 мл образца.

При бессимптомных, вялотекущих формах ИППП, а также при некачественном заборе материала увеличивается риск получения ложноотрицательного результата.

2. Иммунофлуоресцентный анализ (прямая иммунофлуоресценция - ПИФ и РНИФ реакция непрямой иммунофлуоресценции).

ИФлА в обеих модификациях является той же бактериоскопией фиксированных мазков, но с улучшенными показателями чувствительности и специфичности (за счет высокой избирательности взаимодействия АГ выявляемого микроорганизма со специфическими антителами, несущими на себе искусственно присоединенную флуоресцирующую метку на основе ФИТЦ).

3. Иммуноферментный анализ.

Как и в случае ИФлА, используется принцип взаимодействия АГ возбудителей ИППП и специфических антител к ним, однако вместо ФИТЦ в ИФА в качестве метки одного из указанных компонентов применяется фермент (пероксидаза). Каталитические свойства фермента позволяют действовать в качестве усилителей сигнала произошедшей специфической реакции «АГ - АТ». При положительном результате происходит фермент - субстратное взаимодействие с последующим окрашиванием реакционной среды и изменением ее оптической плотности, что позволяет производить визуальную или инструментальную оценку ИФА. Однако в диагностике ИППП ИФА практически не применяется.

4. Наиболее часто в современной отечественной практической медицине применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР), в которой специфическое связывание нативной ДНК возбудителя, с короткими ДНК-фрагментами искусственно синтезированных зондов (праймеров) сопровождается многократным копированием (амплификацией) видоспецифического фрагмента искомой ДНК. Данная технология также не гарантирует от неудач при идентификации возбудителей ИППП.

5. Культуральные методы (КМ).

Разработанные много лет назад посевы материала от обследуемых на искусственные питательные среды, либо на культуры живых клеток во многих случаях остаются эталоном идентификации целого ряда возбудителей ИППП.

Лабораторная диагностика гонореи.

Гонорея - венерическое заболевание, вызываемое грамотрицательным диплококком Neisseria gonorrhoeae. Рекомендуемый алгоритм – бактериоскопия с окраской по Граму и посев на питательные среды. ПЦР диагностика – ценный дополнительный тест.

Трихомониаз – наиболее распространенное заболевание, вызываемое представителем простейших Trichomonas vaginalis. Рекомендуемый алгоритм – бактериоскопия с окраской по Граму и посев на питательные среды, или бактериоскопия с окраской по Граму и ПЦР.

Урогенитальный хладимиоз – заболевание, вызываемое патогенными облигатными грамотрицательными микроорганизмами Chlamydia trachomatis. Клинические проявления УГХ стерты или отсутствуют.

Наиболее благоприятный алгоритм ПЦР – КМ или ПЦР – ПИФ.

Заключение: Надежность лабораторных данных и обоснованность клинических заключений могут быть достигнуты только при сочетании высокого качества выбранных средств лабораторной диагностики, достаточной квалификации персонала лаборатории.

 

Внимание, только СЕГОДНЯ!

Leave a Comment

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *